蛋白质的时空分布对其功能至关重要，但不能直接测量蛋白质丰度。来自科罗拉多大学医学院发表的文章描述了一种基于质谱的蛋白质组学策略，同步蛋白质组定位和转换(SPLAT)，在同一实验中同时测量蛋白质周转率和亚细胞定位。应用该方法，我们发现未折叠蛋白反应(UPR)在人类AC16细胞中对蛋白质周转有不同的影响，取决于它们的亚细胞位置，内质网和高尔基体中的应激反应蛋白在蛋白质组范围内减慢但加速。与此同时，UPR触发了包括RNA结合蛋白和氨基酸转运蛋白在内的蛋白质的广泛差异定位。此外，我们观察到新合成的蛋白质，包括EGFR，在压力下表现出与现有蛋白质池不同的定位，让人想起蛋白质运输中断。接下来，我们将SPLAT应用于用蛋白酶体抑制剂卡非佐米治疗癌症药物心脏毒性的诱导多能干细胞衍生心肌细胞(iPSC-CM)模型。矛盾的是，卡非佐米对蛋白质半衰期几乎没有影响，但可能选择性地破坏肌节蛋白质稳态。本研究提供了蛋白质时空动态相互作用的观点，并展示了一种研究应激和药物反应中蛋白质稳态调节的方法。
蛋白质周转是一个重要的细胞过程，它维持蛋白质库的质量和数量处于动态平衡，并涉及对单个蛋白质合成和分解速率的精细调控。周转动力学与蛋白质的空间分布有密切的关系。细胞器包括细胞质、内质网(ER)和线粒体具有独特的质量控制和蛋白质水解机制，以依赖于定位的方式维持蛋白质折叠和调节蛋白质降解。新合成的蛋白质需要通过亚细胞靶向和分选机制被正确折叠和运输到预期的亚细胞定位，其能力必须协调以匹配蛋白质合成的速度。合成速率和空间定位能力之间的不匹配会导致内质网应激，从而导致新合成蛋白的错误定位。蛋白质周转和体内平衡的破坏广泛涉及人类疾病，包括心肌病、癌症和神经退行性疾病。在应激细胞中，错误折叠的蛋白质积累并触发未折叠蛋白反应(UPR)，其信号抑制蛋白质合成，促进蛋白质折叠和蛋白质水解，以恢复蛋白质稳态。与此同时，UPR会引起蛋白质组的空间重组，例如在急性应激反应中UPR通路介质的瞬时易位到细胞核，以及在内质网相关蛋白降解(ERAD)下错误折叠的内质网蛋白的逆转录易位到细胞质中进行蛋白酶体清除。
我们想知道蛋白质的空间和时间动态是如何调节的。质谱分析方法的进步现在可以大规模地测量蛋白质的周转率和亚细胞定位。蛋白质的周转率和半衰期可以在细胞和完整动物中使用稳定同位素标记来测量，然后使用同位素特征的质谱测量和动力学建模来获得速率常数。周转率的定量比较提供了对蛋白质静态调节的时间视图，并且可以在稳态mRNA和蛋白质水平上暗示新的病理特征和途径。与此同时，空间蛋白质组学方法也增加了大规模识别蛋白质亚细胞定位的能力。在最近的研究中，我们使用了差异溶解度分离策略和质谱分析，在小鼠心脏急性百草枯攻击模型中，我们观察到在三个亚细胞部分中蛋白质的大量重排，这与蛋白质差异定位是蛋白质静止应激下蛋白质组调节的一个重要层面相一致。然而，一种可以同时测量蛋白质周转动力学和空间信息的综合策略迄今尚未实现。
在这项工作中，我们描述了一种实验策略和计算分析工作流程，以在基线和应激细胞中同时进行蛋白质组定位和周转(SPLAT)测量。SPLAT建立在先前的空间和时间蛋白质组分析工作的基础上，通过结合动态SILAC标记、差分超离心、TMT标记和动力学建模，在单个实验和蛋白质组尺度上测量扰动下的转换动力学和亚细胞分布的变化。将SPLAT应用于thapsignargin和tunicamycin诱导的UPR下的人类AC16心肌细胞，我们描绘了蛋白质组的显著时空变化，包括膜转运蛋白定位，可能的膜运输中断和应激颗粒形成。我们还将该方法应用于人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CM)，获得的数据表明，蛋白酶体抑制剂癌症药物卡非佐米可能通过选择性地损害肌体蛋白的转换而产生心脏毒性不良反应。
结果
作者认为，可以使用一种超混合策略，分别在MS1和MS2水平上通过同位素标记同时编码时间和空间蛋白质信息。因此设计了一个工作流程，将培养细胞中的动态SILAC代谢标记与空间分离部分的TMT标记结合起来，同时测量基线和扰动条件下的新蛋白质合成和亚细胞定位(图1a)。为了确定在对照、萨普sigargin和tunicamycin条件下的蛋白质周转率，采用动态SILAC策略来测量标记后合成蛋白质的出现率。简单地说，在药物治疗的同时，用赖氨酸和精氨酸缺失的培养基补充大量标记的赖氨酸和精氨酸来脉冲细胞，标记处理后合成的蛋白质，并通过动力学建模得出分数合成率。
收获后，细胞被分离以分离亚细胞区室。我们采用了蛋白质相关分析方法。特别是，LOPIT-DC (Localisation of Organelle Proteins by Isotope Tagging after Differential ultrac离心)方法17使用顺序超离心来富集来自同一样品的不同亚细胞组分，这便于采用和重复性。简单地说，细胞在温和的条件下裂解，然后通过超离心步骤依次成球，根据它们的沉降速率和粒子质量、形状和体积的函数成球亚细胞组分。随后将各超离心馏分溶解，消化提取的蛋白质，并进一步用串联质量标签(TMT)等压稳定同位素标签进行标记。因此，获得的质谱数据在动态SILAC标签中包含时间信息，在TMT信道强度中包含空间信息(图1b)。
为了处理双同位素编码质谱数据，我们组装了一个定制的计算管道，包括数据库搜索和后处理，以及动态SILAC和TMT数据的量化(图1c)。来自动态SILAC数据的转换动力学信息使用我们之前开发的质谱软件Riana11进行分析，该软件集成了在指定保留时间窗口内肽的质量同位素的面积曲线，然后对单指数模型进行动力学曲线拟合，以测量每个动态SILAC标记(含K和R)肽的分数合成率(FSR)。然后，我们使用pyTMT工具21进行TMT标记定量，校正同位素污染(补充表1)，并分配多肽和蛋白质的超离心分数丰度(见方法)。然后使用MS1编码信息和来自MS2编码信息的亚细胞定位分类的数据进行时间动力学总结(图1d)。通过分别分析重肽和轻肽，可以在正常和受干扰的细胞中同时绘制数千种蛋白质的重(新)和轻(旧)亚库的亚细胞空间信息。
图1:SPLAT策略概述a实验工作流程。用13C615N2-赖氨酸和13C615N4-精氨酸动态SILAC标记对照、塔素素处理和tunicamycin处理的人AC16心肌细胞。对于每种情况，进行3次生物重复SPLAT实验(n=3)。16小时后，收获细胞并进行机械破坏，然后进行差异超离心步骤，使蛋白质颗粒穿过细胞区室。超离心馏分的蛋白质用串联质谱法(TMT)消化和标记。b动态SILAC标记允许在16小时区分预先存在的(未标记的，即SILAC轻)和标记后的(重赖氨酸或精氨酸，即+R[10.0083])合成肽。轻肽和重肽分别被分离并片段化，以便从TMT通道强度中识别包含空间信息的蛋白质沉积谱。c计算工作流。质谱原始数据转换为mzML格式，使用数据库搜索引擎识别肽。质谱和鉴定输出使用Riana(左)来量化SILAC标记强度的时间依赖性变化并确定蛋白质半衰期，并使用pyTMT(右)从每个轻或重肽MS2光谱中提取和校正TMT通道强度。使用pRoloc/handle对TMT数据进行进一步处理，通过监督学习预测蛋白质亚细胞定位。d时间信息和空间信息分别在MS1和MS2级别进行解析。SPLAT允许在正常和受干扰的细胞中同时定量数千种蛋白质的重(新)和轻(旧)亚池的亚细胞空间信息。霍奇金淋巴瘤:半衰期。
CIL提供SILAC稳定的同位素标记产品，如SILAC应用氨基酸助力蛋白质组学研究。
细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)是在细胞培养过程中，利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术，对蛋白表达进行定量分析的一种新技术。它不仅可以对蛋白质进行定性分析，还可通过质谱图上一对轻一重稳定同位素峰的比例来反映对应蛋白在不同状态下的表达水平，实现对蛋白质的精确定量。
原文链接https://doi.org/10.1038/s41467-024-46600-5
